MOE抗体的理性设计教程（05）：Protein Properties——如何从残基性质中寻找抗体优化位点？-北京尧图网络

一、为什么需要计算抗体的理化性质在前面的教程中我们已经利用Protein Contacts分析了抗原–抗体结合界面的相互作用并通过Protein Surface和Protein Patches研究了抗体表面的静电与疏水性质。这些分析可以帮助我们理解抗体如何识别抗原但抗体药物的优化不仅需要关注结合能力还需要考虑其自身的理化性质。例如一个抗体可能具有良好的抗原结合能力却由于存在较大的暴露疏水区域、容易发生化学修饰的残基或不理想的电荷分布而表现出较差的溶解性、稳定性或较高的聚集倾向。因此在抗体理性设计中我们还需要进一步分析抗体表面哪些残基具有较高的溶剂暴露程度哪些残基可能存在氧化等化学稳定性风险抗体的疏水性与电荷分布是否存在潜在问题如何结合残基性质与结合界面信息筛选值得突变的位点MOE提供的Protein Properties功能能够计算蛋白质整体及单个氨基酸残基的多种理化性质帮助我们从分子结构出发识别潜在的优化位点。二、Protein Properties能够计算哪些性质Protein Properties主要提供两类计算结果整体蛋白质性质Protein-level Properties描述整个蛋白质分子的理化特征。残基水平性质Residue-level Properties描述单个氨基酸残基的局部性质。常见的分析指标包括性质含义在抗体设计中的作用Solvent Accessible Surface AreaSASA溶剂可接触的分子表面积分析蛋白质表面暴露情况Residue Exposureres_exp单个残基的相对暴露程度筛选高度暴露的残基Hydrophobic Patch Area疏水Patch的表面积评价潜在的疏水表面风险Electrostatic Patch Area正、负静电Patch的面积分析抗体表面电荷分布Net Charge蛋白质的净电荷辅助分析电荷性质及pH依赖性Residue pKa可电离残基的酸碱平衡特征研究局部质子化状态其中具体可以计算哪些性质取决于所使用的MOE版本、计算对象及所选参数。对于本篇的研究目标我们重点关注残基溶剂暴露程度res_exp。2.1 什么是溶剂可及表面积溶剂可及表面积Solvent Accessible Surface AreaSASA用于描述蛋白质表面能够被溶剂接触的面积。这一概念通常通过一个代表溶剂分子的探针在蛋白质表面滚动来定义。位于蛋白质内部的残基通常具有较小的溶剂可及表面积而暴露在蛋白质外部的残基通常具有较大的溶剂可及表面积。例如在抗体结构中埋藏于Framework内部的某些疏水残基通常具有较低的溶剂暴露程度。位于CDR环区表面的残基则可能具有较高的溶剂暴露程度。需要注意SASA描述的是溶剂能够接触的表面积并不直接表示某个残基是否参与抗原结合。2.2 为什么要关注残基暴露程度残基的溶剂暴露程度与其化学环境密切相关。例如Met甲硫氨酸侧链中的硫醚基团可能发生氧化而其氧化倾向受到局部溶剂环境和结构特征的影响。对于一个高度暴露的Met残基如果它同时位于抗体的重要功能区域就可能成为需要关注的化学稳定性风险位点。类似地其他可能发生化学修饰的残基也可以结合暴露程度和局部结构进行分析。但是高溶剂暴露本身并不代表某个残基一定存在开发风险。还需要考虑氨基酸类型、局部环境以及其对抗体结构和功能的影响。三、使用MOE计算抗体的Protein Properties步骤1加载并准备抗体结构首先打开经过QuickPrep处理的3G6D复合物。MOE | RHS | Open本次计算主要研究CNTO607抗体自身的理化性质因此需要排除IL-13抗原对计算对象的影响。在System Manager中找到抗原链3G6D.A将其设置为Inactive状态同时隐藏抗原的显示。保留抗体重链和轻链作为当前的分析对象。需要注意仅仅隐藏抗原的Ribbon不一定意味着该链被排除在计算之外因此应检查对应的激活状态。步骤2打开Protein Properties在MOE主菜单中选择MOE | Protein | Properties...随后打开Protein Properties面板。在该面板中可以看到两个主要功能区域Property Calculation用于选择需要计算的性质、设置计算对象和环境条件并启动性质计算。Property Viewer用于查看计算结果包括整体性质、残基性质及部分指标随环境条件变化的结果。在课程示例使用的MOE界面中Protein Properties提供112项可选性质其中默认选择28项进行计算。不同版本的具体数量可能有所变化。步骤3设置计算参数在Property Calculation面板中首先检查Source是否设置为当前MOE窗口中的结构。随后确认需要计算的性质。对于本次案例可以保留默认选择的性质并重点关注与残基暴露和疏水性相关的指标。此外Protein Properties还可以设置计算环境例如pHTemperatureSalt Concentration这些参数可能影响蛋白质的质子化状态、电荷分布及部分性质计算结果。本篇以单个结构的基础性质分析为主可以使用当前默认条件完成计算。如果后续需要比较不同pH条件下的蛋白质性质则需要进一步设置相应的计算条件。步骤4运行Protein Properties计算确认计算对象和性质后点击CalculateMOE会对当前选定的蛋白质结构进行性质计算。计算完成后结果将显示在Property Viewer中。通过结果列表可以查看已计算的整体蛋白质性质包括不同表面Patch相关指标和其他理化性质。四、使用Residue Table分析单个氨基酸的性质蛋白质整体性质可以反映抗体的总体特征但在实际突变设计中我们还需要知道具体哪些氨基酸残基可能存在优化空间。因此本篇的重点是Protein Properties中的Residue Table功能。步骤5打开Residue Table在Property Viewer中点击Residue TableMOE将显示蛋白质各个残基的性质计算结果。表格中包含残基所属蛋白链、残基名称及不同性质指标。通过这个功能我们可以对残基进行排序、筛选并将选中的残基与MOE三维结构关联。步骤6按照res_exp排序在Residue Table中找到res_exp这一字段用于描述残基的相对溶剂暴露程度。点击res_exp列标题对残基按照暴露程度进行排序。在示例操作中可以通过点击两次使其按照降序排列。随后点击Res按照氨基酸类型进行排序。这样可以将相同类型的氨基酸集中显示并根据其溶剂暴露程度进行比较。例如可以将所有Met残基集中查看比较不同Met在蛋白质中的暴露程度。这里需要注意res_exp属于相对暴露性质不能直接与以Å²表示的绝对SASA数值混用。不同性质字段的具体定义与数值范围应以MOE相应属性说明为准。五、案例分析为什么Met92是值得关注的优化位点步骤7寻找Met92在Residue Table中滚动至MetMET残基所在的位置。找到抗体轻链中的MET92在当前3G6D结构中Met92位于抗体的CDR-L3区域。选择MET92所在的记录然后点击Select随后关闭Residue Table并使用MOE主界面右侧的Center将三维视角调整至Met92所在的位置。从计算结果可以观察到Met92具有较高的残基暴露程度说明其侧链在当前结构中具有较高的溶剂可接触性。5.1 为什么Met92可能存在氧化风险甲硫氨酸MethionineMet是一种含硫氨基酸其侧链中包含硫醚基团。在一定条件下Met侧链可能发生氧化形成甲硫氨酸亚砜等氧化产物。对于治疗性抗体Met氧化可能影响局部结构、稳定性或生物学活性具体影响取决于该残基所处的位置和环境。在CNTO607中Met92具有两个值得关注的特征位于CDR-L3靠近抗原结合区域。具有较高的溶剂暴露程度可能存在氧化相关的开发风险。因此Met92可以作为潜在的抗体优化位点进行进一步研究。但是需要强调Protein Properties不能直接预测Met92在实际制剂条件下的氧化速率。当前结果主要用于提示可能存在的结构风险并不意味着Met92一定会发生严重氧化。步骤8结合抗原表面分析Met92的局部环境仅凭Met92的溶剂暴露程度还不足以判断应该如何进行突变。由于Met92位于抗原结合区域我们还需要进一步检查该残基与IL-13之间的相互作用。首先在System Manager中重新显示并激活IL-13抗原链3G6D.A随后利用之前介绍的Protein Surface功能生成抗原表面并将Color设置为Lipophilicity通过观察可以发现Met92所接触的IL-13局部表面具有较强的亲水特征。这说明Met92的非极性侧链与抗原局部环境之间可能存在优化空间。例如可以考虑将Met92替换为具有一定极性的残基并进一步评价替换后的氢键网络、结合评分和稳定性。不过选择更极性的氨基酸并不一定能够改善结合亲和力因为突变还可能引起侧链构象、去溶剂化和局部相互作用网络的变化。步骤9使用SiteView观察Met92的局部环境为了更加清楚地观察Met92附近的残基可以先清除不需要的Surface和Patch对象避免其遮挡局部结构。随后选中Met92点击MOE右侧工具栏中的SiteViewMOE将视角调整至所选残基附近并显示其周围的局部结构。在该区域可以进一步观察Met92与抗原邻近残基的空间关系例如Asn19和Asn23等残基。这些局部结构信息可以帮助我们判断如果将Met92替换为其他氨基酸是否可能形成新的极性相互作用。六、如何利用Protein Properties筛选抗体优化位点通过Met92的案例可以将残基性质分析总结为一个较为通用的思路。首先利用Protein Properties计算残基性质。例如使用res_exp筛选具有较高溶剂暴露程度的残基。其次根据残基类型判断潜在风险。对于Met等具有潜在化学修饰风险的残基可以优先关注其结构位置及局部环境。最后结合抗原–抗体相互作用与表面性质判断优化价值。对于位于CDR或抗原结合界面的残基需要考虑替换后是否可能破坏原有的相互作用。可以通过以下几个维度综合评价评价维度对应分析方法主要作用残基暴露程度Protein Properties识别高度暴露的残基化学稳定性风险残基类型与局部环境分析识别潜在氧化或其他修饰风险抗原结合情况Protein Contacts判断是否参与重要的界面接触表面疏水性质Protein Patches分析局部疏水区域抗原表面互补性Protein Surface观察电荷及疏水性质的匹配情况需要强调以上分析主要用于筛选潜在优化位点而不是直接确认最佳突变方案。对于筛选出的残基还需要进一步建立突变结构并通过亲和力及稳定性计算评价不同替换方案。七、进阶静态性质计算与构象集合计算有什么区别本篇主要采用单个蛋白质结构进行性质计算。但蛋白质并不是完全静止的结构尤其是抗体的CDR环区及部分表面侧链可能具有一定的构象柔性。因此基于单一结构计算得到的残基暴露程度或表面Patch面积只能反映当前构象下的性质。在MOE中Protein Properties还支持基于构象集合Ensemble的性质计算。这种方法可以通过采样多个蛋白质构象或质子化状态再综合计算相关性质从而考虑部分构象变化和环境条件的影响。例如抗体表面疏水Patch的面积可能随着CDR构象变化而发生改变因此构象集合分析可能比单个静态结构更适合某些性质预测任务。不过构象集合计算通常需要更多计算资源而且其结果仍然受到采样方法和评分模型的限制。对于初步的抗体优化位点筛选使用静态Protein Properties结合三维结构分析已经可以提供有价值的参考信息。八、常见问题Q1为什么有些残基的res_exp很高却不一定存在开发风险res_exp描述的是残基的相对溶剂暴露程度。高暴露残基并不一定具有不利的理化性质其实际影响还取决于氨基酸类型、局部环境及蛋白质功能。因此不能仅根据res_exp的高低直接判断抗体是否稳定。Q2Protein Properties可以直接预测Met的氧化概率吗不能。Protein Properties可以帮助识别Met的暴露程度及局部结构环境但氧化反应还受到溶液条件、氧化剂暴露、蛋白质构象等因素影响。因此Met的实际氧化敏感性仍需要结合实验进行评价。Q3为什么计算Protein Properties之前需要排除抗原本篇的研究目标是分析抗体自身的理化性质因此需要避免将抗原作为计算对象的一部分。此外结合态与游离态的蛋白质其表面暴露情况可能不同。如果希望评价抗体自身的聚集风险通常应重点考虑抗体单独存在时的表面性质而不是将抗原遮挡后的结合界面直接视为抗体的天然暴露状态。Q4为什么Protein Properties与Protein Patches得到的信息不同Protein Properties主要提供可用于比较、排序和筛选的数值性质而Protein Patches侧重于识别和显示具有特定物理化学特征的表面区域。两者之间并不矛盾而是可以互相补充。例如Protein Patches能够帮助我们定位较大的疏水区域而Protein Properties可以进一步提供相关的面积指标和残基性质。九、本篇小结本篇以CNTO607–IL-13复合物为例介绍了MOE的Protein Properties功能重点学习了蛋白质及残基性质计算、Residue Table排序以及利用res_exp分析残基溶剂暴露程度的方法。通过对Met92的分析我们发现该残基位于CDR-L3区域具有较高的溶剂暴露程度并可能存在氧化相关的开发风险。结合前面教程中的Protein Contacts和Protein Surface分析还能够进一步理解其在抗原结合界面中的局部环境。这些结果为抗体理性突变提供了候选位点但是否能够通过突变改善抗体性质还需要进一步的结构与能量评价。下一篇预告MOE抗体的理性设计教程06Protein–Protein Docking——如何预测抗原–抗体的结合模式下一篇将介绍MOE蛋白质–蛋白质对接的基本原理和操作流程学习如何利用抗体CDR区域设置对接约束并以CNTO607–IL-13为例预测和分析抗原–抗体的结合构象。

MOE抗体的理性设计教程（05）：Protein Properties——如何从残基性质中寻找抗体优化位点？

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